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技术科普!详解构建细胞株的步骤

点击次数:151 发布时间:2019-12-25
   技术科普!详解构建细胞株的步骤
  转染-筛选-扩增-单克隆化-筛选-驯化
  首先,通过质粒将目的蛋白的编码基因导入到细胞内。质粒上除了目的基因外还带有抗性基因,比如抗生素抗性基因。这样在转染后就可以利用选择压力富集整合质粒的细胞。在哺乳动物细胞中质粒不能进行复制,未整合到基因组中的质粒随着细胞分裂逐渐丢失。在一段时间的选择压力后,所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。
  获得了一系列整合了外源基因的稳定细胞后,接下来就需要从中筛选出表达量zui高的克隆。常用的方法是检测96孔细胞培养板中蛋白的浓度;另外一个方法是让细胞在软琼脂上生长形成集落,然后利用原位免疫沉淀技术获得高产细胞。
  通常使用的转染方法主要有DNA-磷酸钙共沉淀法,电击法,脂质体法。
  质粒DNA的基本元件
  外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的,同时质粒DNA上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件。尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被用来将外源基因导入动物细胞,但是工业上在构建细胞株的过程中极少用到病毒来源的载体。
  筛选标记可以分为显性的和隐形的。隐形筛选标记是细胞内固有的基因,缺失时影响细胞生长(如DHFR)。通过引入外源补偿基因可以克服这类缺陷。比如,CHO DG44 细胞是DHFR基因双敲除的细胞株,需要在培养基中添加HT才能正常生长。通过转染使其获得功能性的DHFR基因,就能使它在不含HT的培养基中也能生长。
  哺乳动物细胞中常用的两种基因扩增系统是:二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)系统。DHFR是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸的酶,四氢叶酸是甘氨酸、胸苷一磷酸和嘌呤生物合成所必需的。氨甲喋呤(MTX)是叶酸的类似物,可以与DHFR结合并抑制其活性。从而使细胞在缺乏胸苷和嘌呤的培养基中死亡。
  细胞驯化
  确定生产用细胞株后,需要尽快使其适用生产规模下的培养条件。
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